人尿源性干细胞的永生化及其诱导分化研究

【摘要】目的：运用piggyBacsystem筛选在干细胞中能启动基因表达的高效启动子，选择合适的启动子应用于猿肾病毒40大T抗原（SV40Tag）基因的表达，建立永生化的人尿源性干细胞（urinederivedstemcell，USC）。通过对永生化尿源性干细胞的生物学鉴定，明确其干细胞分化潜能，并通过骨形成蛋白（BMP9）诱导分化，进一步明确永生化尿源性干细胞具有多向分化潜能，为组织工程学及再生医学提供新型的稳定的细胞来源。方法：运用piggyBac转座酶系统构建并比较带有不同启动子的质粒，用红色荧光蛋白（RFP）和萤火虫荧光素酶（fireflyluciferaseFluc）作为报告基因，通过脂质体转染的方法建立稳定表达的细胞系。通过RFP表达强度，Fluc定量检测及流式细胞技术，筛选在干细胞中稳定高效表达的启动子。利用该启动子构建带SV40Tag基因表达的质粒，将SV40Tag基因质粒及转座酶质粒（transposase）共转染至临床分离的人尿源性干细胞中。潮霉素（Hygromycin）筛选后阳性细胞克隆并连续传代，观察细胞形态学以及增殖情况，RT-PCR，免疫荧光等检测转染细胞的生物学特性，细胞裸鼠皮下注射检测其安全性。运用BMP9诱导成骨分化，通过体外细胞碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色（Alizarin-Sstaining）、油红O（Oil-redstaining）染色、微团细胞培养（MicroMass）等特异性染色检测其成骨、成软骨及成脂分化。体内实验进一步利用Micro-CT，病理切片染色等检测尿源性干细胞在BMP9诱导下具有多向分化功能。结果：通过RFP荧光显示，Fluc及流式细胞定量检测，hEFH启动子在干细胞系中表达外源基因能力明显强于其他启动子，运用hEFH启动SV40Tag基因在尿源性干细胞中表达，筛选获得的阳性克隆扩大培养，即永生化尿源性干细胞（immorterlizedurinederivedstemcell，iUSC），增殖能力强，能连续传代培养。RT-PCR证实iUSC表达SV40Tag基因，而用翻转重组酶（FlippersrecombinationenzymeFlp）处理iUSC可敲除RFT-SV40Tag基因而逆转永生化。应用免疫荧光细胞化学技术检测该细胞株表达干细胞表面标志物CD73、CD44、CD90(Thy-1)、CD29(Integrin)、CD105(Endoglin)、CD166（ALCAM）、BMPRII、SSEA4、CD117、CD133。应用BMP9诱导iUSC分化，细胞碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红O染色等显示该细胞向成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化，转染细胞裸鼠皮下及肌肉接种，4周后无肿瘤形成，通过Micro-CT及病理切片染色等显示该细胞在BMP9诱导下，在体内具有良好的成骨成软骨及部分成脂多向分化潜能。结论：运用piggyBacsystem成功筛选出适合于干细胞基因表达的启动子hEFH，并用该启动子通过脂质体转染技术成功构建SV40Tag永生化尿源性干细胞，生物学鉴定该细胞具有间充质干细胞特性，利用BMP9诱导分化，在体内体外实验都证实该细胞具有成骨、成脂、成软骨分化功能，进一步证实了永生化人尿源性干细胞的多分化潜能，可以进一步诱导分化用于泌尿生殖系统的损伤修复，并为组织工程学及再生医学的体外研究和发展应用提供了安全稳定的细胞来源。
【作者】温晟；
【导师】魏光辉；
【作者基本信息】重庆医科大学，儿科学，2014，博士
【关键词】干细胞；永生化；再生医学；BMP9；启动子；

【参考文献】
[1]孟旭东,糜正琨.软交换网络体系结构和SIP协议[J].现代电信科技.2002(07)
[2]陈栋.WT-1、ER及PR在卵巢浆液性癌中的表及意义[D].华中科技大学,病理学,2012,硕士.
[3]董凤芝.大型国有企业实施CRM对策研究[D].吉林大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[4]赵喆.中国案例指导制度的构建与完善[D].郑州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[5]阮浩.水下无线传感器网络节点定位算法的设计与实现[D].南京邮电大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[6]陈泽华.陕西农村广播的民俗文化传播研究[D].西北大学,新闻学,2013,硕士.
[7]刘正凡,蔡晨晓,段文勇,邹云.不确定切换时滞非线性系统状态切换的指数稳定性[J].控制与决策,2014,12:2247-2252.
[8]刘建中.碳纳米管与金属氧化物复合材料的制备及储锂性能的研究[D].苏州大学,2014.
[9]王印肖.论林木种苗与林业可持续发展[J].绿色中国.2005(11)
[10]徐筱林.碳纳米管从碳纤维表面剥离机制分子模拟研究[D].哈尔滨工业大学,工程力学,2013,硕士.
[11]明锦郎.为城市特色增色为当代建设增辉[J].新建筑.1992(03)
[12]马兰.中国移动通信B分公司全面预算管理研究[D].吉林大学,工商管理,2012,硕士.
[13]滕宇.吉林省粮食单产效率的聚类分析及对策研究[D].东北师范大学,统计学,2012,硕士.
[14]陈彬.中国东部海域细颗粒沉积物中重金属源汇效应和其对人类活动响应[D].中国海洋大学,海洋地质,2014,博士.
[15]杨中.基于视频图像的混合手势识别研究[D].浙江大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[16]胡立新,杨德宽,何兵寿,魏修成.延迟爆炸法的理论分析[J].石油地球物理勘探,2002,01:33-38+98.
[17]丁艳秋.单回路调节器在混合煤气热值控制系统中的应用[J].冶金自动化,1993,02:52-54.
[18]王黎智.基于RUP的物理实验教学系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[19]师帅.前置反硝化生物滤池的脱氮效能与微生物群落结构解析[D].哈尔滨工业大学,微生物学,2014,硕士.
[20]董艳.渍水胁迫对大豆生理特性和产量的影响[D].南京农业大学,农村与区域发展,2011,硕士.
[21]冯子齐.鄂尔多斯盆地东南部山西组海陆过渡相页岩储层特征与评价[D].中国地质大学（北京）,矿物学、岩石学、矿床学,2014,硕士.
[22]洪增林.服务机器人的知识表达和智能推理[D].浙江大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[23]孙万章.燃气行业的自动仪表读数技术[J].城市公用事业.1995(04)
[24]杨曦.LTE物理层下行控制信道的研究与仿真[D].哈尔滨工业大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[25]路雪.天津市城市广场地域特色营造研究[D].安徽建筑大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[26]吴昊.C篇:京津城际铁路对京津地区经济社会发展的作用[J].铁道经济研究,2009,04:15-19.
[27]沈静.试论现当代绘画对伊斯兰细密画装饰语言的借鉴与发展[D].青岛科技大学,美术学,2012,硕士.
[28]徐瑶.从《海尔堪大神传奇》看锡伯族“海尔堪玛法”信仰[D].辽宁大学,民俗学,2012,硕士.
[29]朱金艳.从人体空间到建筑空间[D].西南交通大学,艺术设计,2013,硕士.
[30]王洁.促进学生自主学习的翻译教学个案研究[D].北京第二外国语学院,德语语言文学,2014,硕士.
[31]薛亚丽.离心泵叶轮切割对泵性能及其蜗壳内部流场影响的数值研究[D].兰州理工大学,流体机械及工程,2014,硕士.
[32]桂思怡.基于DirectX的立体装箱系统3D可视化技术研究[D].大连海事大学,工业工程,2014,硕士.
[33]宋敏敏.胡晓梅主任医师应用雄黄温阳化毒治疗骨髓增生异常综合征的学术经验及雄黄活性成分As_2S_2作用机理的体外研究[D].北京中医药大学,中西医结合临床,2014,硕士.
[34]王莉.S公司研发人员激励机制改进研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[35]闫晓静.351例过敏性紫癜住院患儿临床分析[D].河北医科大学,儿科学,2014,硕士.
[36]王群.通货膨胀下的企业盈亏计量研究[D].河北大学,会计,2014,硕士.
[37]王大伟.轮胎复合滑移离散仿真模型建模[D].吉林大学,车辆工程,2014,硕士.
[38]赵佳.非洲留学生汉语学习策略研究[D].东北师范大学,对外汉语,2012,硕士.
[39]李彦豪.并购基金法律问题研究[D].四川省社会科学院,民商法学,2014,硕士.
[40]白欢欢.基于变刚度弹性支承的液压管路流固耦合振动的数值分析[D].燕山大学,机械电子工程,2014,硕士.
[41]赖文龙.研究性写作与多元读者[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[42]黄飞隆.有机膦离子液体的合成及其作为功能材料的应用[D].宁波大学,无机化学,2014,硕士.
[43]张凤清.忆阻细胞神经网络的建模及应用[D].西南大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[44]马爽.小学课堂突发情景应对策略的隐性知识及其影响因素[D].宁夏大学,应用心理学,2014,硕士.
[45]王嘉兴.Sirtuins与肝细胞癌预后及浸润性γδT细胞功能缺陷的关系研究[D].复旦大学,外科学,2013,博士.
[46]马国浩.实物期权法在企业并购价值评估中的应用[D].首都经济贸易大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[47]林霖.皮质下缺血性血管病患者的扩散张量成像分析和认知功能相关研究[D].福建医科大学,影像医学与核医学,2014,硕士.
[48]赵巧.财务报表重大错报风险对审计收费影响的实证研究[D].吉林大学,会计,2013,硕士.
[49]姜艳青.轨道车辆车厢LED照明控制系统研究[D].长春工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[50]仲硕.我国商业银行盈利模式研究[D].首都经济贸易大学,金融学,2014,硕士.